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WB实验的基本常识

WB的基本原理

在电场的作用下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测，经常用于目的蛋白的表达特性分析、组织定位、表达量分析及与其他蛋白的互作。依其原理，可分为两种方法：A、直接法和B、间接法。

两种的方法的优缺点比较：WB的一般流程：蛋白的提取需谨记：好的蛋白是WB成功的一半！经验总结：1.合适的盐浓度下，保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。2.尽量除去核酸、多糖、脂类等干扰分子3.提取蛋白质过程中，应在低温环境下进行，以抑制蛋白酶的水解作用（可加入适合的蛋白酶抑制剂）。4.蛋白样品建议分装后冷冻干燥或直接以液体态置-80℃中保存，不要反复冻融。5.蛋白浓度低时，可使用超滤膜浓缩或者用真空冻干机将蛋白冻干。

重点来了

VE-转移电泳槽是用来对少量核酸及蛋白质样品进行转移电泳的装置

操作简便，方便环保

创新设计，同时可以转印四块凝胶

做到一槽多用，可节省实验空间和经费

性能特点

槽体采用高强度和高透明度的聚碳酸酯材料注塑成型，免除液体渗漏的困扰。

多重安全设计，免除了可能产生的操作安全问题。

安全按钮式的开盖设计，方便电泳槽盖的开启。

专用开启式转移胶架，操作方便。

可同时转印四块9×9cm凝胶

专用蓝冰盒可反复使用，方便环保。

转印时间为15-60min，也可选择低电压过夜。

可以与VE-微型垂直电泳槽配套使用

流行外型设计，精品理念，超越国外同类产品同样水平。

具体课程介绍详见后文或戳图片链接

#后续会有更多干货哦#

1、关于蛋白提取：

Q1：裂解buffer：每种裂解buffer都有其擅长的用途，市面上常见的裂解buffer见下表：

Tips：

除了这些裂解buffer以外，为了防止蛋白降解、去磷酸化，各种蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂都是必须的；在提取蛋白的时候仅仅靠裂解液有时候也不能达到完全抽提的效果，有条件的话，可以对抽提悬液进行10-20s的超声破碎处理；此外如果没有裂解buffer，可以用1×SDSloadingbuffer代替来抽提蛋白，其效果类似于SDS裂解液，不过抽提后的样本不能进行浓度测定。

Q2：干扰蛋白：

培养细胞、动物组织都存在血清成分，血清中存在大量的白蛋白与免疫球蛋白，这些蛋白会经常性的出现杂带干扰，一般白蛋白杂带在70kDa处，免疫球蛋白杂带出现在50kDa处；有人怀疑：“我的抗体也不识别这些蛋白啊！”，现实不是这样的，当某种蛋白含量超过一定量的时候，即使很少的非特异吸附都有可能造成信号的富集而造成杂带；建议广大战友在提取细胞蛋白的时候，一定要使用PBS漂洗细胞至少3次，去除残留的培养基成分；提取组织的时候，尽量去除组织中血液的残留，这样样本中的干扰因素才会减少到最低。

Q3：关于胶浓度及电泳条件的选择

正确选择凝胶浓度与电泳条件能够让目的蛋白区域最大限度的分离开，从而使条带的位置，杂带位置等一些因素的影响降到最低；胶浓度及电泳条件的选择见下表：

Q4：关于转膜的条件与注意事项

1、转膜条件：

对于分子量10-15kDa的指标转膜时间不宜过长，V、冰浴45min足矣；对于分子量指标kDa以上的指标，V、冰浴2h也足够了；其他介于15-kDa之间的指标V、冰浴1h完全可以保证效果。

2、转膜操作：

准备PVDF膜的大小要与切割后的凝胶大小一致或略小，滤纸和海绵大小也要一致；制作“三明治”不能太厚也不能太薄，太厚容易使胶变形，条带弯曲，太薄气泡容易进入，导致条带不完整，这些都可以用增加减少滤纸量来改善；一定要把目的蛋白分子量区域贴在膜的中间部位；分清楚正极与负极，避免反方向转印；转印缓冲液要提前预冷，整个转印过程也需要在冰浴中进行。

经验总结：1.上样时：根据蛋白表达丰度调整蛋白上样量，尽量保证每孔上样量保持一致。2.胶最好现配现用，如果需要保存，最好用湿润的保鲜膜包好并置于4℃冰箱中。3.为了检测整个实验系统或校准实验结果，需要设置内参（一般指由管家基因编码表达的蛋白）。

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