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来自东北大西洋环节动物Eupolymnianebulosa的三取代硫戊烷:Nebulosins
一、研究背景
海洋药物研究经历近半个世纪的探索和发展，已经获得了许多宝贵的经验积累和丰富的研究资料。目前来说，海洋代谢产物研究多集中于海绵和线虫，还有细菌和真菌。先前有研究者从环节动物中分离得到Thelepamide(图1)，后来又有报道从海绵中分离到相似结构，于是对这类代谢产物的真正生源产生疑问。
图1Thelepamide
爱尔兰国家海洋生物研究资料库包括大约种经筛选的潮间带和潮下带已确定的海洋无脊椎动物。环节动物Eupolymnianebulosa引起了研究人员的注意，认为它可能是这类化合物的真正生产者，原因是对其馏分的质谱分析包含了含硫代谢物的同位素模式，且裂解方式类似。
二、构建分子网络
在爱尔兰西海岸的潮间带采集了分布广泛的Eupolymnianebulosa，并用RP-SPE分离了1g干重的CH3OH/CH2Cl2萃取物。然后用UHPLC-HR(+)ESIMS分析随后的组分。将处理好的数据提交给全球天然产物社会分子网络(GNPS)平台。MS/MS分子网络显示三个主要群集，并分析发现三个主要群集的节点之间有12个MS2峰共享，突出了相似的化学特征。这些发现，再加上对UV和ELSD(蒸发光散射探测器)谱图的分析，推测这三个群集中包含的节点代表了Eupolymnianebulosa产生的主要代谢物。因此，作者通过构建的网络寻找包含这些MS2峰值的节点，以便将它们作为主要分离目标。
图2分子网络分析结果
三、结构确定
本文作者分离和鉴定了16个具有三取代硫戊烷母核的Nebulosins(1-16),其中化合物7-16为硫原子被氧化。根据HRESIMS和13CNMR确定了化合物1的分子式为C12H23NO2S,通过分析1HNMR、13CNMR、COSY、HMBC谱图和ESI(?)MS谱确定了化合物1的平面结构，ESI(?)MS中m/z.和m/z.信号碎片进一步确认了硫环的结构，同时推测δC69.4(C-2)处的信号消失与C-2处羧酸的存在相关。
图3化合物1的平面结构及部分谱图
根据NOESY结合耦合常数分析确定了化合物1的相对构型，尽管NOE对于五元环的使用有时会受到质疑，但在构象分析和原子间距离分析后，这些结论得到了证实。通过比较实验和计算ECD，确定了1的绝对构型。将化合物1归于2S，5S类。
图4化合物1的立体构型确定
经HRESIMS测定，化合物2分子式为C12H23NO2S同1相同。然而，1H核磁共振谱与1的谱图明显不同。对COSY和HMBC谱图的分析表明，1和2具有相同的平面结构，因此确定1和2是立体异构体。根据NOESY结合耦合常数分析确定了化合物2的相对构型，与化合物1相比，化合物2的构型发生了变化。质子H-3和H-7之间的大耦合常数(9.5Hz)说明它们处于假直立排列，而不是1中的假平伏排列，并且环构象的变化使得C-2/C-3键与环对齐，这种排列引起了H-2/H-3二面角的变化。最后，通过实验和计算的ECD谱的比较，确定了2的绝对构型。因此，1和2是C-5的差向异构体，将2归属于2S，5R类。
图5化合物2的立体构型确定
化合物3、4、5显示了与化合物1和2相似的MS/MS裂解图谱，关键片段位于m/z.(C10H17S)、.(C11H22NS)、.(C11H19O2S)和.(C12H24NO2S)，表明其骨架相同。通过分析1HNMR、13CNMR、COSY、HMBC谱图可知与1相比N上取代基不同，分析NOE、耦合常数和ECD将3、4、5归属于2S，5S类。
化合物6的分子式为C14H25NO3S，具有三个不饱和度。HRESIMS表现出与前几个化合物相似的裂解模式，说明具有相同的取代硫戊环母核。通过分析1HNMR、13CNMR、COSY、HMBC谱图确定了平面结构。对NOESY结合耦合常数分析表明，化合物6与化合物1的环构象和H-2和H-3二面角是相同的。但化合物6的H-3、H-7和H-8的化学位移与化合物3、4相比有显著差异。这可以用6的C-2上的异构化来解释。实验和计算的ECD谱之间的比较最终确定绝对构型为2R，3S，5S，7S。因此，化合物6归属于2R，5S类。
图6化合物6的立体构型确定
HRESIMS提示化合物7分子式为C16H29NO4S，分析1HNMR、13CNMR和HMBC谱可知，C-5与C-3的化学位移值显著增大，表明硫杂环硫原子周围电子云发生了变化，结合分子式分析S-氧化物的存在比较合理，MS/MS证实了这一观点，其m/z.处的关键片段对应于氧化Nebulosins骨架C12H23NO3S。结合COSY和HMBC谱确定7的平面结构，通过分析NOESY谱、耦合常数确定了除亚砜以外的手性中心，通过比较计算和实验的1H和13C核磁共振数据确定了亚砜的相对构型。使用ECD计算与实测比较确定了绝对构型。实验数据与2S、3S、4R、5S、7S构型的计算数据相匹配，将7归属于2S，5S类。
根据HRMS数据，化合物8与化合物7具有相同的分子式。HRMS/MS的碎裂模式提示为氧化Nebulosins骨架。1HNMR、COSY、HSQC和HMBC谱的分析支持与7相同的平面结构。通过对耦合常数、NOESY谱、H-5的化学位移确定了C-2、C-3、C-5和C-7上的相对构型与化合物2相同，通过计算核磁，确定了亚砜的相对构型。然后使用计算的ECD谱，确定了2S，3S，4R，5R，7S构型，将8归属于2S，5R类。
图7化合物7、8的计算与实测核磁数据比较
通过HRESIMS确定分子式，通过特征的HRMS/MS碎片峰确定母核，1H、COSY、HSQC和HMBC谱的分析确定了平面结构。通过对耦合常数、NOESY谱对比分析确定了相对构型。通过ECD谱确定了绝对构型。将化合物9、12、14归属于2S，5S类。将化合物10、13、15归属于2S，5R类。
根据HRESIMS确定化合物11分子式为C14H25NO4S。对比化合物9和10，11的核磁数据和HRMS/MS表明它们具有相同的平面结构。因为化合物的量少，根据NOESY谱不能确定相对构型。对于化合物来说，不含酰胺的两个分子（1和2）的ECD光谱与含有酰胺的分子有很大的不同。这表明，酰胺发色团对于曲线的形状是比较重要的。酰胺基团2S、5S分子在~nm处表现出强烈的正Cotton效应，在nm处表现出强烈的负Cotton效应。而2R,5S基团的光谱特征与2S,5S基团相反。但是2S,5R分子的ECD谱没有明显的趋势，但由于杂环结构影响，这类基团的曲线将与2S,5S分子相似。化合物11的ECD中的Cotton效应与化合物9相反。这使得推测11的相对构型为2R，3S，4R，5S，7S。绝对构型通过计算11的ECD谱的验证，因此11被归属于2R，5S类。同样，化合物16也属于2R，5S类
图83类基团不同的ECD光谱
四、MS/MS裂解模式
m/z.、m/z.和m/z.为化合物1?6特征片段，m/z.和m/z88.为化合物7-16氧化型特征片段，通过特征碎片能快速解析化合物，同时探究生源途径提供了非常大的帮助。
图9Nebulosins主要裂解方式
五、生合成途径推测
Thelepamide以前是从海洋环节动物中分离出来的。Nebulosins与其相似，前人认为起其源于从tetraketide和半胱氨酸残基之间的T?M缩合。研究人员推测这种缩合由立体选择性的酶催化。而C-3和C-7之间的连接比较困难，由于从样品中分离得到许多亚砜，作者认为亚砜可能先是通过硫原子上的立体选择性氧化形成的，而不是先形成硫杂环最终再氧化形成的。因此，氧化后C-3位置上的异构化可以发生，这也可以解释观察到的2S，5R族化合物在C-5的异构化，因为进攻C-7位上的羰基时具有立体选择性。后续有两条通向Nebulosins氧化物的途径：(1)一步立体选择性脱羟基或(2)区域选择性脱水，然后将双键还原。双键的存在使C-2上的异构化成为可能。最终，Nebulosins氧化物的还原形成Nebulosins。
图10Nebulosins生合成推导
六、抗氧化活性评价
通过抗氧化能力(ORAC)测定，评价了Nebulosins及其氧化物(除5、10、11和16以外)的抗氧化活性。根据ORAC结果分析，属于2R，5S组的化合物6表现出最强的抗氧化作用，而2S，5S组的化合物表现出中等的抗氧化能力(约占Trolox活性的30%)。观察到属于2S，5R组的化合物的活性明显降低（2、8、13、15），表明C-5的S构型对星云蛋白的抗氧化能力很重要。此外，除了非酰胺类物质1和2外，观察到非氧化的化合物具有更强的抗氧化活性。作者团队又进行了细胞ROS分析，所有的化合物在一个或多个浓度下都表现出超过20%的抗氧化能力，其中以6的活性最高，这加强了ORAC体外试验的结果。
图11抗氧化活性评价
七、总结
从Eupolymnianebulosa分离得到16个新的代谢产物，并进行了解析，命名为Nebulosins，在分离的16个化合物中，有10个氧化硫原子母核。通过分子网络分析证明C簇包括氧化物。除了(14)和(15)外，所有报道的氧化物都在C簇中被发现。未氧化的化合物包含在分子网络的A簇中。最后，对B簇的研究发现，在质谱仪的ESI源中存在电离过程中产生的二聚体。并研究了Nebulosins生合成途径和抗氧化活性。
本文的突出亮点在于运用了分子网络策略（GNPS）作为一种高效导向分离手段，对于快速分离和后续研究均具有重要意义。分离得到的多取代硫戊烷在天然产物中比较少见，且氧化型母核的存在对于其生合成探究具有指导作用，同时本文作者找到特征碎片并总结了这类结构的质谱裂解规律。其次在对化合物进行解析时，总结了这类结构的ECD规律，能够快速确定部分化合物绝对构型。在确定多取代硫戊烷的立体构型时，还是应该进行更详尽的描述，给读者一个直观的理解。
指导教师：黄肖霄
